微型生物反应器与高通量菌种筛选

 

       生物技术和生命科学将成为 21世纪引发新科技革命的重要推动力量，人类所面临的健康、疾病、食品、医药制造、能源、环境等一系列问题成为这一时期最重要的内容。以微生物发酵技术为核心的新一代工业生物技术正在发挥越来越重要的作用，功能菌株（高产菌种）的构建与大规模筛选技术被列为重点研究的新一代工业生物技术之一。

1、国内外菌种生产水平存在差距

        全世界微生物发酵产品市场规模约为 200亿美元，其中抗生素占 46%，从世界趋势看，抗生素市场正以 8%的平均年增长率高速发展，而我国市场每年的增长更是超过 20%。几大抗生素品种的原料药生产主要集中在我国。如我国青霉素年产量超过 6万吨，占世界份额约 90%，原料药销售中有超过 60%为出口。再如维生素 C全球产能超过 13万吨，需求量一般保持在 9万吨左右，主要由六大企业掌控：石家庄制药集团、华北制药集团、东北制药集团、江山制药有限公司以及荷兰帝斯曼公司和德国巴斯夫公司。而国内四大企业产能已经超过 9万吨，中国已成为全世界维生素 C供应商主要基地，中国维生素 C出口的国家和地区超过 150个。我国已经成为名副其实的发酵大国，但是由于种种原因，我国的发酵技术水平仍处于落后地位，其中菌种的发酵水平与国外先进技术相比有相当大的差距。如青霉素国外菌种发酵效价为每毫升发酵液近20万单位，而我国目前只有 10万单位左右；红霉素发酵能力国际上已经超过 1.5万单位 /mL，国内最高水平仅有8000～ 10000单位 /mL。我国其他发酵产品的菌种生产能力基本上都同样面临落后于国际水平的局面。因此，提高工业生产菌种的发酵能力是提升我国发酵工业整体水平的重要基础。

2、我国菌种选育技术发展现状

         常用的菌种选育技术（ strain impr­ovement）根据其原理可分成随机选育（ random screening）和理性选育（rationalized selection）两大类 ^①。虽然以分子生物学为基础的基因工程、代谢工程以及由各种组学组成的系统生物学研究为定向构建功能细胞株提供了广阔前景，但要真正实现以这些功能细胞培养来达到改造目标却极其困难。由于微生物体内代谢网络的复杂性和多结点性，基因操作后菌株的代谢流往往并不朝着预期设计的方向转移。尤其是在产生抗生素等次级代谢产物的复杂体系中，要想得到优良的工业生产菌株，主要还是采用随机选育技术，包括自然选育、诱变育种和以原生质体融合为代表的杂交育种技术，但筛选工作量大，费时费力。这是因为产量的高低属于数量性状，遗传学上由多基因决定，一次诱变和筛选很难有大幅度提高，需要多轮诱变筛选才能逐渐积累到一定的高产特性，这一点不同于以发现化合物为目标的菌种筛选。因此从菌种选育实践来看除了一些用代谢工程方法改造的初级代谢产物生产菌株外，不论采用随机选育还是理性选育，都无法绕开大量繁琐的菌株筛选工作 ② 。另一方面，无论是随机选育还是理性选育，经典的菌种初筛和复筛都是在没有任何检测参数的摇瓶或试管中进行的，筛选过程微生物的外在培养环境与工业发酵生产存在巨大反差，很多真正符合实际生产环境、性状优良的菌种往往在筛选初期就被漏筛掉了 ； 菌种筛选和筛选后发酵工艺设计与优化工作是分开、顺序进行的，两者之间缺少技术参数的联系，导致摇瓶筛选到的优良菌株与实际工艺条件产生不对应性，因而许多优良菌株的高产性能很难在工业生产中体现出来。这种筛选模式在我国沿用了半个多世纪而没有明显改进。由此可见，在菌种选育领域，亟需开展多参数的与发酵工艺过程相结合的高通量菌种筛选技术和方法的研究。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3 、高通量菌种筛选的国际研究进展
        近几年用于微生物菌种高通量筛选（high-throughput screening）的装置及相关技术不断发展和成熟 ③～ 。国外发明了多种全自动高通量筛选系统，可以进行培养基灭菌、 倒平板、 挑取单菌落、分装发酵培养基、接种、抽提、HPLC（高效液相色谱）分析和数据自动收集处理等过程，即组合成一套连续的自动化系统，实现高效自动化筛选，从而大大提高筛选效率。国际上菌种筛选技术正朝着高通量、微型化、自动化和仪器化方向发展，其中生物反应器微型化是当前发展的重要趋势。如美国马里兰大学、 麻省理工学院、 德国雷根斯堡大学、英国伦敦大学等都在加紧开发具备高通量特性的微型生物反应器 ③ ~ ⑧ ，有些产品已经在不少大型制药公司得到商品化应用。

 

 

 3.1　微型生物反应器
      目前国际上出现的微型生物反应器在结构上大体包括三类 ： 孔板式微反应器（microtiter plate，MTP，参见图 1） ④～⑥ 、基于现有摇瓶或发酵罐原型缩微化的分体式微反应器（miniature bioreactor，MBR，参见图 2） ⑦ 和微流控芯片实验室（microfluid-based lab-on-a-chip，参见图 3） ⑧～⑩ 。微型生物反应器虽然形式各异，但都具有以下功能和特点 ： ①多参数在线检测功能，可同时测量 pH 值、DO（dissvloed oxygen，溶解氧） 、 P co 2 、OD（optical density，光密度）等重要参数 ； ②高通量分析功能，在一台微反应器上集成的微发酵罐数可达 6、12、24、48、96 个不等 ； ③体积小，其体积一般小于 100 mL，有的甚至小至 5mL ，微流控芯片则为 nL 级规模。此外，还有造价低、减少昂贵原材料消耗、降低劳动强度等优势。生物反应器的微型化主要是基于光化学传感技术在发酵中的成功应用。光化学传感器的测定原理是 ： 特定波长的激发光照射到事先加入培养基内的某种荧光染料指示剂或固定于生物反应器内壁上含有荧光染料指示剂的（patch，即化学传感器）上（参见图 4） ，指示剂产生发射光或光吸收，并被检测器检测到，根据培养基内氧气或二氧化碳含量的不同（或 pH 值变化） ，检测到的荧光强度也不同，据此而定量溶液中的 DO、P co 2 或 pH 值。与过去基于电化学原理设计的传感器不同，光化学传感器是一种非接触式传感器（non-invasive sensor） ，因此最大程度地减少了在线检测对发酵状态的干扰，也解决了染菌问题 ，且便于缩小反应器。而且光化学传感器成本低廉，其费用为传统电化学电极的1/20 ～1/10。

   

 

 

 

 

 

 

 

  

 

 

 

 

 

3.2　孔板式微反应器（MTP）
      微孔板是自动高效筛选的标准方式 ： 筛选自动化，结果定量化，可与自动化机械、液体处理系统、光学读板仪等相匹配。MTP 有各种格式可提供（6~1536孔） ，但 24 孔、48 孔和 96 孔格式是最常用的。MTP 最先是在分析领域得到 应用，现在广泛应用于组合化学、生物转化、 微生物发酵和细胞培养筛选研究。美国 Biolog 公司开发了一种表型分析微阵列（phenotype microArray，PM）系统。该系统可以同时提供 2000 多种不同的培养条件，用以检测微生物的生长、呼吸、代谢等不同的表型。该高通量培养系统包含了 200 种碳源、400 种氮源、100 多种磷源和硫源、100 种营养补充剂以及不同范围的 pH 值、渗透压、离子浓度等生长环境。通过这些预设的生长条件，可以实现对不同品系细胞或突变体的生理特性或遗传特性的快速和高通量检测。目前，该系统已经成功地在数千种不同的细菌、真菌、哺乳动物细胞的表型快速筛选中得到了成功应用。这对药物开发、微生物检测、食品安全等相关领域产生了巨大的影响力。M24 是一个深孔板格式的微型反应器系统（参见图 1） ，包含 24 个圆柱形无挡板的深孔（微反应器） ，工作体积为5mL。每个孔内配置了非接触式 pH 值、DO 和温度传感器、热导体、0.2mm 喷气膜（可透过混合空气、氧气、氮气、二氧化碳和氨，参见图 4） 。每个孔上端用透气帽密封，起到隔菌的作用。M24 深孔板可置于温育箱中培养。Chen 等首次报道了用 M24 作为常规实验室规模发酵罐的缩小模型进行动物细胞悬浮培养工艺开发。考察了 pH 值、DO 测量、温度控制的精度 （参见图 5 和图 6） 。从 pH 值、DO、温度、细胞生长、产物形成和蛋白质量参数方面与 2L 工作体积的常规台式反应器进行了比较，结果显示有很好的一致性，说明该系统适合作为细胞培养过程研究的缩小模型应用。

3.3　分体式微型生物反应器（MBR）

     Harms 等报道了一种 24 位分体式MBR 系统（参见图 2） ，每个反应器的工作体积为 1mL。除为每一个微型反应器配备独立的非接触式在线 DO、pH 值传感器外，还安装了由步进电机驱动的搅拌控制，最大可以提供 1000 r/min 的转速。这个系统的优势是每个微型反应器可以灭菌、允许放在净化台上操作、各个反应器可以控制不同的转速。该系统在 E.coli 发酵中表现出很好的 DO、pH值、OD 的重现性和控制 DO 的可能性。Ge 等报道 12 个微型发酵罐组成的 MBR系统，微反应器的直径是 30mm，高度为 78mm，工作体积大约为 30mL（参见图 7） 。每个反应器底部同样配备了传感器，以SP20/0 骨髓瘤 / 鼠杂交瘤细胞系为试验对象，通过转录分析表明光传感系统不影响细胞生理特性。
 

3.4　微流控芯片系统
      近年来微流控技术的发展为微生物用 PMMA 制作了一种可实现 OD、pH值和溶解氧实时监测的微流控连续发酵反应器 ⑧ （参见图 3） 。Groisman 等利用PDMS 加工制作微腔阵列作为高通量的微生物发酵反应器 ⑨ ，该芯片通过在相邻的微腔之间设计坝形结构将微生物细胞群体限制于各微腔内生长，同时保证液体通过坝形结构在各微腔中的流动，实现营养物质的更新和代谢产物的移出，该微型发酵反应器可以简单地实现高通量的微生物连续发酵。Zhang 利用该发酵芯片进行了大肠杆菌和酵母细胞的高密度培养实验以及单细胞生长监测实验。不过，该发酵芯片功能过于简单，仅包含菌种导入和营养物质更新功能以及一个可调节因素 —— 温度，与实际发酵控制过程相差较远。且该芯片无法避免细菌生物薄膜（biofilm）的形成（细菌生物薄膜会消耗大量生长底物） ，难以保证发酵反应器发酵工作的长期有效性和稳定性。加州理工学院的Balagaddé 等利用多层软光刻技术制作了一种基于半连续发酵方式的微流控发酵反应器 ⑩ ，该芯片包含 6 个独立平行运行的 16 nL 发酵单元，每个单元通过精细设计和密集排列的微通道、微阀和微泵来实现微生物发酵过程中的多步处理过程。每个发酵循环操作除了不断灌注营养物质和排出发酵液外，还涉及一个裂解液灌注、清洗的操作，该操作可防止发酵芯片管壁上形成细菌生物薄膜，保证发酵芯片长期工作的有效性和稳定性。虽然该芯片具有较完善的功能，但是通量较低（仅 6 个独立单元） 。随着微型化技术的出现，微流控装置的开发显著增长。研究表明微流控系统在提高分析性能、降低实验室安全要求、降低成本，缩短分析时间和减少试剂用量方面是非常有前景的                           

3.5　机器人系统
       机器人系统从 20 世纪 90 年代后首先开始在化学和药物领域中用于开展化学分析，后来对标准的实验室自动化方案进行适当修改，用于工业发酵工艺开发。不同于在生化分析研究中的应用，微生物培养对机器人系统有一些特殊要求，比如足够的氧供应、适宜的生长温度控制、尽可能小的样品蒸发以及避免交叉污染和简单可靠的过程控制。图 8 是 基 于 Sagian Core System 和SAMI 3.3 控制软件（Beckman-Coulter，Fullerton，CA） 集 成 的 自 动 化 高 通量发酵系统 ，整个机器人系统被安装在一个封闭的箱体内，箱体尺寸是4.9m×2.3m×2.2m。整个箱体有温湿度控制，并集成了顶部中央轨道机械手、条形码阅读器、盖板站、封板器、液体处理装置、摇床、光度计、离心机、冷藏室等。这个自动化系统可以在没有手工介入的情况下平行地实现样品准备、运行、监控 768 个（16 个 48 孔板）好氧微型化发酵实验，虽然期间因采用了
半连续荧光检测技术而要求短暂的停止震摇，但这并不明显影响细胞培养实验结果。该系统以 E.coli 和 Saccharomyces
cerevisiae 为培养对象进行了功能验证，
 

4、展　望
      就我国科研单位和企业的经济实力而言，近期甚至将来很长一段时期内尚无法推广国外这些价格高昂、自动化程度高的高通量筛选设备，因此自主研发基于微反应器的高通量工业生产菌种的筛选技术和装置是提高我国功能菌株大规模筛选技术的必经之路，形势刻不容缓，否则会造成与国外菌种技术差距越来越大。可喜的是国内开展了这方面的研究开发工作   ，上海百仑在微型生物反应器及多通道生物反应器的研究与制造方面走在前沿